专题1基因工程
1.1DNA重组技术的基本工具
1.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，因此又叫做DNA重组技术，这种技术是在生物体外，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。
2.基因操作的工具包括基因的“剪刀”――限制性核酸内切酶；基因的“针线”――DNA连接酶；基因的“运输工具”――运载体。
3.限制酶主要来源于原核生物。限制酶的作用特点是能够识别DNA中某种特定的核苷酸序列，切开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
4.DNA连接酶的作用是将双链DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二脂键。根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：T4DNA连接酶和E.coliDNA连接酶。
5.目前基因工程中经常使用的运载体有质粒、动植物病毒和λ噬菌体的衍生物。
6.质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
7.作为基因进入细胞的载体，必须具备的条件是能在宿主细胞中复制并稳定保存、具有一至多个限制酶切点、具有某些标记基因、对宿主的生存没有决定性的作用。
1.2基因工程的基本操作程序
1.基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
2.目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。获取目的基因的途径有从基因文库中获取?、利用PCR技术扩增获得、直接人工合成。
3.PCR是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列加以复制，使其数目呈指数方式增加。需要的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶的作用下进行延伸，如此重复循环多次。
4.基因工程的核心是基因表达载体的构建，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
5.一个基因表达载体的组成有：目的基因、启动子、终止子和标记基因。
6.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。采用最多的方法是农杆菌转化法，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中的染色体DNA上，使目的基因的遗传性状得以稳定维持和表达。
7.基因工程选取原核生物作为受体细胞的原因是由于其具有其他生物没有的一些特点，如繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等
8.大肠杆菌常用的转化方法是：先用Ca2+ 处理细胞，再将载体DNA分子溶于缓冲液中与此种细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
9.检测目的基因是否成功插入到转基因生物的染色体上的方法是采用DNA分子杂交技术，此方法使用的探针是同位素标记的含有目的基因的DNA片段，与检测目的基因是否转录出mRNA所用的探针一样。检测目的基因是否翻译成蛋白质，检测方法是从转基因生物体内提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。除了上述的分子检测外，有时还需要进行个体生物学水平的鉴定，如对抗虫植物做抗虫的接种实验。
1.3基因工程的应用
1.植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
2.抗病转基因植物所采用的基因，使用最多的是病毒外壳蛋白基因和病毒的复制基因；抗真菌转基因植物中可使用的基因有几丁质酶基因和抗毒素合成基因。
3.在培育抗逆转基因植物中，使用调节细胞渗透压的基因来提高农作物的抗盐碱和抗干旱的能力；将鱼的抗冻蛋白基因导入烟草和番茄，提高它们的耐寒能力；将抗除草剂基因导入作物，使作物抗除草剂。
4.在利用转基因改良植物的品质方面，我国科学家将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米，获得的转基因玉米中赖氨酸的含量比对照提高30%。
5.动物基因工程从诞生那天起，就在动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等很方面显示了广阔的前景。
6.乳腺生物反应器的操作过程为：将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的受精卵中，然后，将受精卵送入母体内，使其生长发育成转基因动物。
7.为解决器官移植中的免疫排斥反应，科学家正在想办法对猪的器官进行改造，采用的方法是将器官供体基因组导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达或设法除去抗原决定基因，结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
8.基因治疗是把正常基因导入病人体内使该基因的表达产物发挥作用，从而达到治疗疾病的目的。其方法可以分为体外基因治疗和体内基因治疗。
1.4蛋白质工程的崛起
1.蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人们生产和生活的需求。与基因工程合成的蛋白质的主要区别是基因工程只能合成自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程可合成一些自然界中原本不存在的蛋白质。
2.玉米中赖氨酸含量较低，原因是赖氨酸合成过程中两种酶――天冬氨酶激酶和二氢吡啶二羧酶合成酶的活性受细胞内赖氨酸浓度的影响，当赖氨酸达到一定量时会抑制这两种酶活性。
3.蛋白质工程的基本途径中预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找出对应的脱氧核苷酸序列。
专题2细胞工程
2.1植物细胞工程
2.1.1植物细胞工程的基本技术
1.植物的花瓣属于高度分化的组织，利用它来培育出新的植株，首选要经过激素的诱导，使其脱分化成为具有分生能力的薄壁细胞，进而形成愈伤组织。再经过一定的条件培养，又可以再分化出根和芽，形成完整的小植株。
2.每个植物都具有全能性的特点，原因是每个细胞中都具有某种生物的全部遗传信息。
3.在植物的生长发育过程中，细胞并不会表现出全能性，而是分化成各种组织和器官，原因是细胞中的基因会选择性表达出各种蛋白质，从而构成植物的不同组织和器官。
4.植物的组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配置的培养基上给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。
5.植物组织培养全过程，证明了分化的植物细胞仍具有形成完整的植物所需要的全部基因。
6.番茄和马铃薯不能进行传统的杂交，原因是它们是两个不同的物种，因此它们之间想想着天然的生殖隔离，但是，如果采用体细胞杂交的方法，就能得到“番茄-马铃薯”杂种植株，这各方法成功的关键是：
①利用纤维素酶和果胶酶除去细胞壁获得具有活力的原生质体；②原生质体融合。
成功的标志是融合后的杂种细胞再生细胞壁。
7.进行原生质体间的融合，必须要借助一定的技术手段进行人工诱导。人工诱导的方法基本可以分为两大类――物理法和化学法，物理法包括离心、振动、电激等；化学法一般使用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂来诱导细胞融合。
8.植物体细胞杂交就是将不同种的植物体细胞，在一定的条件下融合成杂种细胞，并将其培育成新的植物体的技术。植物体细胞融合引起的变异属于染色体变异。
9.植物细胞工程常采用的技术手段有植物组织培养技术和植物体细胞杂交技术等。
2.1.2植物细胞工程的实际应用
1.植物的微型繁殖技术又称快速繁殖技术，其意义是①可以保持优良品种的遗传性状；②高效快速地实现大量繁殖。
2.植物长期进行营养生殖，病毒会在作物体内逐年积累，结果导致作物产量降低、品质变差。如果用分生区（茎尖）作为组织培养的材料，就会培育出无病毒的脱毒苗，用脱毒苗进行快速繁殖，种植的作物就不会或极少感染病毒。
3.所谓人工种子，就是以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到种子，人工种子在适宜的条件下同样能够萌发长成幼苗。人工种子由人工种皮、胶质和胚状体三部分组成，其中的胶质相当于单子叶植物种子的胚乳或双子叶植物种子的子叶。人工种皮的制备是生物膜结构和功能的研究深入到分子水平的体现。
4.通过花药培养获得单倍体，再经过人工诱导使染色体加倍，即可得到稳定遗传的优良品种。这项技术称为单倍体育种，其优点是明显缩短育种年限。该技术所依据的遗传学原理是染色体变异。
5.在植物的组织培养过程中，由于培养的细胞一直处于不断分生状态，因此容易受到培养条件和外界压力的影响而产生突变，从这些生产突变的个体中可以筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。
6.植物组织培养技术除了在农业上的应用外，还广泛应用于细胞产物的工厂化生产等领域，可获得蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱等细胞产物。
2.2动物细胞工程
2.2.1动物细胞培养和核移植技术
1.动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
2.将从健康的动物体内取出的组织块剪碎，加入胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间后，组织块就会分散成单个细胞。对动物细胞进行培养时，要求培养皿或培养瓶内表面光滑、无毒、易于贴附；当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。
3.贴满瓶壁的细胞需要重新用胰蛋白酶处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这样的培养称为传代培养。细胞传代至10代～50代左右时，增殖会逐渐减慢，以至于完全停止，但少部分细胞会克服寿命的极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展。
4.动物细胞培养的条件包括无菌、无毒的环境，营养，温度和pH，气体环境。
5.动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个胚胎最终发育成为动物个体。
6.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，因为这样的细胞能保持正常的二倍体核型。通过细胞核移植方法生产的克隆动物，并不是对核供体动物100%的复制，因为生物的性状除受细胞核基因控制以外，还受细胞质基因和外界环境的影响。
7.体细胞核移植技术的应用前景有：促进优良畜群繁育；保护濒危动物；克隆人的细胞、组织、器官，进行器官移植等。
2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体
1.动物细胞融合常用的诱导因素有聚乙二醇（PEG）、灭活病毒、电激等。细胞融合技术的优点是突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。
2.制备单克隆抗体的技术流程是：用羊的红细胞对小鼠进行注射，使小鼠产生免疫反应。然后，把相应的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，再用特定的选择性培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同一种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。这种杂种细胞的特点是既能迅速大量繁殖又能产生专一性的抗体。对上述经选择性培养的杂交瘤细胞，还需进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。最后，将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠的腹腔内增殖，这样，从细胞培养液或小鼠腹腔中，就可以提取大量的单克隆抗体了。
3.单克隆抗体最主要的优点是特异性强、灵敏度高和可大量制备。
4.如果把抗癌细胞的单克隆抗体跟放射性同位素、化学药物或细胞毒素相结合，制成“生物导弹”注入体内，借助单克隆抗体的导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞。这样既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量。
专题3胚胎工程
3.1体内受精和早期胚胎发育
1.胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。
2.哺乳动物精子的发生是在雄性动物的睾丸内完成的。
3.哺乳动物的成熟精子分为头、颈和尾三部分。其中头部主要由一个细胞核构成，高尔基体发育成顶体，中心体演变成尾，线粒体聚集在尾的基部形成鞘膜，细胞内的其他物质浓缩为球状，叫做原生质滴。
4.哺乳动物卵子的发生是在雌性动物的卵巢内完成的。卵母细胞的减数第一次分裂是在雌性动物排卵前后完成的，其结果是产生一个次级卵母细胞和第一极体，进入输卵管，准备与精子受精。减数第二次分裂是在精子和卵子结合的过程中完成的，次级卵母细胞经分裂产生一个成熟的卵子和第二极体。在卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，说明卵子已经完成了受精。
5.受精是指精子与卵子结合成合子（受精卵）的过程，受精是在输卵管内完成的。
6.哺乳动物的受精过程主要包括：精子穿越放射冠和透明带，进入卵黄膜，原核形成和配子结合。
7.获能后的精子与卵子相遇时，首先发生顶体反应，使顶体内的酶释放出来，溶解卵丘细胞之间的物质，形成精子穿越放射冠的通道。随后精子与透明带接触，再将透明带溶出一条孔道，精子借自身的运动穿越透明带，并接触卵黄膜。在精子触及卵黄膜的瞬间，会产生透明带反应，防止多个精子进入卵内，这种生理反应称作卵黄膜封闭作用。
8.精子进入卵子后发生的变化，首先是尾部脱离，并且原有的核膜破裂；随后，精子形成一个新的核膜；最后形成一个比原来精子核还要大的核，叫雄原核。与此同时，卵子完成减数第二次分裂，排出第二极体后，形成雌原核。
9.胚胎发育的早期有一段时间是在透明带内进行的，这一时期称为卵裂期。其特点是：细胞分裂方式为有丝分裂，细胞的数量增加，每个细胞的体积减小，胚胎的总体积不增加。
10.根据胚胎形态的变化，可将早期发育的胚胎为桑椹胚、囊胚、原肠胚三个时期。细胞开始出现分化的时期是囊胚。
11.在原肠胚时期，内细胞团表层的细胞形成外胚层，下方的细胞形成内胚层。滋养层则发育为胎儿的胎膜和胎盘。由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。
3.2体外受精和早期胚胎培养
1.试管动物技术是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育为早期胚胎后，再经移植产生后代的技术。
2.对于小型家畜，卵母细胞的采集采用的主要方法是：用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后从输卵管中取出卵子，直接与获能的精子在体外受精。
3.对于大型家畜，卵母细胞的采集采用的主要方法是：从屠宰场已经屠宰的母畜的卵巢中采集卵母细胞，也可以借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜等工具，直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。
4.收集精子的方法有假阴道法、手握法和电刺激法。
5.通常采用的精子体外获能的方法有培养法和化学诱导法。
3.3胚胎工程的应用及前景
1.胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育成为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个体称为受体。
2.胚胎移植的生理学基础：
①供、受体生殖器官的生理变化是相同的，为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。
②哺乳动物的早期胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而处于游离状态，这就为胚胎的收集提供了可能。
③受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体子宫内的存活提供了可能。
④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织上的联系，且移入受体的供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受任何影响。
3.胚胎移植主要包括对供、受体的选择和处理，配种或进行人工授精，对胚胎的收集、检查、培养或保存，对胚胎进行移植以及检查等步骤。
4.胚胎分割是指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份、8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。
5.在进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚。在对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要注意将内细胞团均等分割。
6.胚胎分割的局限性：同卵分割成功的比例很小，难以做到均等分割。
7.哺乳动物的胚胎干细胞是从早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞。在形态上，表现为体积小、细胞核大、核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，即可分化为成年动物体内的任何一种组织细胞。
8.胚胎干细胞可以用于治疗人类的某些顽症；培育出人造组织器官；揭示细胞分化和细胞凋亡的机理。
